A polimeráz láncreakció egy molekuláris biológiai eljárást jelent, amely megismétli a genetikai anyag szakaszait (dezoxiribonukleinsav, DNS). Milliárd azonos kópiát állít elő kis mennyiségű DNS-ből. Ily módon olyan mennyiségek állnak rendelkezésre, amelyek elegendőek a különféle vizsgálatokhoz.
Mi a polimeráz láncreakció?
A polimeráz láncreakció egy molekuláris biológiai módszer, amely megismétli a genetikai anyag szakaszait (dezoxiribonukleinsav, DNS). A polimeráz láncreakció (PCR) kifejezés az in vitro (latinul: a pohárban) reakciót írja le egy enzim, a polimeráz (DNS polimeráz) segítségével, amely bizonyos gén szekvenciák. A reakció terméke a reakció új ciklusának kiindulási anyaga is. Száma molekulák duplázik, és egyben sablonként szolgál egy új ciklushoz. Ezt exponenciális szorzásnak nevezzük. A laboratóriumban nagy, néhány perces sebességgel zajlik, hasonlóan a láncreakcióhoz. Ez a laboratóriumi folyamat utánozza a replikáció során természetes körülmények között előforduló genetikai információ (DNS) duplikációját. KB Mullis amerikai vegyészt tekintik ennek a folyamatnak a felfedezőjeként. 1983-ban bevezette ezt a DNS-szintézis folyamatot, és tíz évvel később megkapta a kémia Nobel-díját.
Funkció, hatás és célok
Élő organizmusokban a benne lévő DNS kromoszómák olyan hosszúságú, amelyet PCR-rel nem lehet amplifikálni. Ehelyett egy meghatározott szakasz felerősítésére alkalmazzák. Ezek lehetnek gének, az a specifikus része gén, vagy régiók, amelyekre nincs átírva fehérjék, azaz nem kódolók. Ezek a szakaszok általában legfeljebb háromezer bázispárból állnak, szemben a készletenként kétszer hárommilliárd bázispárral kromoszómák emberekben. A polimeráz láncreakcióhoz egy- vagy kétszálú DNS-láncra van szükség, amelynek felépítését legalább részben ismerni kell. Az enzim, a polimeráz mellett két primert használunk. Ezek a DNS építőkövei, amelyek kiindulási és végpontként működnek. Olyan szekvencia jellemzi őket, amely pontosan megfelel az amplifikálandó régiónak. A laboratóriumban a polimeráz láncreakciót programozható fűtőblokkban hajtják végre. A szükséges komponensek, például a polimeráz, az alapozó, az új szál felépítésének építőkövei (dezoxiribonukleozid-trifoszfátok) és magnézium ionokat adunk össze pufferoldatban. A reakció hőmérséklet-idő programja 94 ° C feletti hőmérsékleten történő denaturálással kezdődik. Ebben a folyamatban a kettős szálú DNS hasad és egyszálú formában van jelen. A következő lépésben, körülbelül 70 ° C-on, az alapozót a gén szekvenciát és képezi az enzimreakció kiindulópontját. Innentől a polimeráz szintetizálja a komplementer szálat. Ezután egy új ciklus kezdődik, amely ismét a denaturáció, a primerkötés és a DNS-szál szintézisének három lépéséből áll. A polimeráz láncreakciót az igazságügyi orvostudományban, a klinikai diagnosztikában és a klinikai kutatásban használják. Az igazságügyi tudományban a DNS-t kivonják bőr, nyál, haj, sperma vagy vér bűnügyi helyszínekről, és az amplifikációt követően összehasonlították az ismert mintákkal, és meghatározott személyek azonosítására használták fel. Ezen genetikai ujjlenyomat felhasználásával az apaság módosított megközelítéssel is tisztázható. A betegségek tisztázása során a polimeráz láncreakciót alkalmazzák az érintett gének igazolására. Egyes bakteriális betegségek specifikus szekvenciák felismerésével osztályozhatók. A vírusos betegségek akkor jellemezhetők, amikor a vírus DNS vagy RNS transzformálódik és amplifikálódik. Ban ben vér szűrés, lehetséges detektálni májgyulladás vagy a HIV által közvetített betegségek nagyon korai szakaszában. A tumordiagnosztikában a tumorsejtek azonosítására szolgál. Ez lehetővé teszi a daganat osztályozását, a betegség lefolyásának, a betegség sikerének felmérését terápia és a prognózis. A kutatás során a polimeráz láncreakciót használják a különféle betegségekkel összefüggő gének azonosítására. A gének klónozásához, amely nem azonos a szervezet klónozásával, a gént felerősítik, mielőtt egy vektorban más organizmusokba viszik át (latinul: utazó, hordozó ). Ezek modellként szolgálhatnak a betegségek jobb tanulmányozásához vagy előállításához fehérjék hogy felhasználható szerek.
Kockázatok és veszélyek
A polimeráz láncreakció hatalmas potenciállal rendelkezik a DNS kis mennyiségének kimutatásában. A lehetőségek sokaságának kiaknázása és a jelentős hibák elkerülése érdekében bizonyos előfeltételeket és különféle hibaforrásokat kell figyelembe venni. A genetikai anyagnak csak azok a szakaszai erősíthetők fel, amelyek szekvenciája legalább részben ismert. Teljesen ismeretlen szekvenciákat nem lehet ezzel a módszerrel felerősíteni. Az amplifikáció termékei utólag láthatóvá válnak. Ha a várt jel nem látható, bár a keresett szekvencia jelen volt, akkor hamis negatív eredmény van jelen. Leggyakrabban ez nem optimalizált vagy rosszul optimalizált reakciókörülmények eredménye. Ezeket a célszekvencia függvényében kell meghatározni. Erre a célra különböző hőmérsékleti és időprofilokat, primer szekvenciákat és mennyiségeket, valamint a reakcióelegyben lévő egyéb anyagok koncentrációit tesztelik. A hamis pozitív eredmények jelekként jelennek meg, amelyek nem rendelhetők hozzá a kívánt termékhez. A legnagyobb problémákat a DNS-szennyeződések okozzák, amelyek a kutatótól származnak, vagy az elemzésen kívüli forrásból származnak. A bakteriális eredetű DNS szintén befolyásolja a polimeráz láncreakció eredményét. Kesztyű viselésével és nagy körültekintéssel az ilyen hibák megelőzhetők, és megbízható következtetéseket lehet megfogalmazni az amplifikált termékekről.
