Patch-clamp technika az elektrofiziológiai méréstechnika neve. Lehetővé teszi az ionáramok mérését a plazmamembránon belüli egyes csatornákon keresztül.
Mi a patch-clamp technika?
A patch clamp technika vagy patch clamp módszer az elektrofiziológiához tartozik, amely a neurofiziológia azon ága, amely a jelek elektrokémiai továbbításával foglalkozik idegrendszer. E módszer segítségével lehetőség van az egyes ioncsatornák vizualizálására sejt membrán egy testsejt. Ez magában foglalja néhány picoamper áramának mérését. A patch-clamp technikát először 1976-ban írták le Erwin Neher német biofizikus és Bert Sakmann német orvos. A két tudós 1991-ben fiziológiai vagy orvostudományi Nobel-díjat kapott a szorítófolt technika fejlesztéséért. Így az elektrofiziológiai kutatásokat gyakorlatilag forradalmasította a patch-clamp technika, mert ez megnyitotta a lehetőségét a membrán elektromos viselkedésének megfigyelésére fehérjék az egyén molekulák. A patch kifejezés az angol nyelvből származik és azt jelenti, hogy „patch”. A tapasz pipetta alatt egy kis membránszakaszra utal, amelyet mérőelektródaként használnak. A mérési folyamat során a membrán tapaszt rögzítik vagy rögzítik (a rögzítéshez) a meghatározott potenciálokhoz.
Funkció, hatás és célok
A patch-clamp technika elektrofiziológiai elemzési módszer. Biológiai tényen alapul, hogy a sejtek nagyszámú pórusokkal és ioncsatornákkal rendelkeznek. Az egyes sejteken belül és kívül különböző ionkoncentrációk vagy töltések fordulnak elő, amelyek a sejt fiziológiai állapotától függenek. A membrán lipid kétrétege nem áteresztő víz molekulák valamint az ionok. Mindazonáltal a töltött részecskék cseréje végbemegy a sejt membrán szabálytalan időközönként. Ennek oka az ioncsatornák feszültségfüggése. Ha elér egy bizonyos membránpotenciált, akkor a csatornákat a „minden vagy semmi” elve alapján nyitják meg. Pontosan itt jön be a tapaszbilincs technika. Ily módon egy mérőpipettát egy ioncsatornába juttatnak anélkül, hogy behatolna a sejt membrán. Ily módon pontosan meghatározható a helyi elektromos potenciál. A szivárgási áramokat, amelyek befolyásolhatják a mérés eredményét, általában el lehet kerülni a pipetta éle és a sejtmembrán közötti elektromosan rendkívül szoros kapcsolatokkal. A patch clamp módszer a feszültség bilincs technikáján alapszik. Ezt a technikát az 1930-as években Kenneth Stewart Cole amerikai biofizikus fejlesztette ki (1900-1984) az ép idegsejtek áramának mérésére. A feszültségszorítóban két elektróda egy cellába történő behelyezése történik parancs vagy tartófeszültség biztosítása érdekében. Ugyanakkor egy másik elektródot használnak a membránon átmenő áramok rögzítésére. Ha a neurofiziológusok tudni akarnak az elektromos áram áramlásáról a idegsejt membrán, a tapaszbilincs technikát használják. Ehhez egy finom üveg pipettát használnak, amelyet a cella külsejére helyeznek. Negatív nyomás hipodermikus fecskendő segítségével történő felszívódással hozható létre. Ennek az eljárásnak a hatására a membrán kissé kidomborodik a megfelelő helyen. A negatív nyomás biztosítja az üveg rögzítését a membránhoz. Ez a pipetta kis membránfoltjának elektromos izolálását eredményezi a membrán többi részétől. Az elektromos áramok mérésére a neurofiziológusok tapaszbilincs-erősítőt használnak. Ez egy speciális mérőeszköz. Ideális esetben a tudós az eszköz segítségével információkat szerezhet az egyes ioncsatornák elektromos tulajdonságairól. Az ioncsatornák szabályozzák például a be- és kiáramlást nátrium pozitív töltésű ionok az idegsejtekben. A vizsgálat emberek, növények vagy állatok sejtjein zajlik. A patch-clamp módszert általában egy mérőállomáson hajtják végre, amely különféle eszközöket tartalmaz. A rezgéscsillapított mérőasztalon egy úgynevezett Faraday ketrec található, amely elektromos pajzsként szolgál. Ezenkívül rendelkezésre áll egy mikromanipulátort tartalmazó optikai mikroszkóp a tapasz pipetta helyzetbe hozásához. Ezenkívül a pipettatartó csatlakozik egy előerősítőhöz, míg a mintatartó egy fürdőelektródához van csatlakoztatva. A patch bilincserősítő az előerősítő jelének erősítésére szolgál. Monitor is rendelkezésre áll a DUT, valamint a tapasz pipetta megfigyelésére. A legtöbb esetben számítógép és több adattároló eszköz is rendelkezésre áll a mérőasztalnál a digitális rögzítés lehetővé tételéhez.
Kockázatok, mellékhatások és veszélyek
A patch-clamp technikával nincsenek kockázatok. Például az emberekből, állatokból vagy növényekből származó sejteket csak azok eltávolítása után vizsgálják. A külső sejtmembránhoz ritkán van korlátlan hozzáférés. Emiatt gyakran szükséges a cellákat előkészíteni a patch-clamp módszerhez. A tapasz pipetta megtöltése után egy mikromanipulátorba rögzítjük. Ez a patch bilincserősítőhöz csatlakozik, és finoman az ép cellára nyomja. A folyamat monitorral vagy mikroszkóppal követhető. A pipetta alatt egy membrándarab ül, az úgynevezett membránfolt. A pipetta hátsó végén keletkező enyhe negatív nyomás erős kapcsolatot biztosít a pipetta és a membrán között. Ez a folyamat elektromos ellenállás létrejöttét eredményezi a külső megoldás és a pipetta belseje között több gigaohm között. A tudósok ezt „gigaseal” -ként is emlegetik, amely lehetővé teszi a tapasz-szorító módszer sejtekhez kötött konfigurációjának elérését. A tapasz ioncsatornáján átáramló áram a magas gigasealis ellenállás miatt a pipetta tartalmán is átáramlik. Az erősítőhöz csatlakoztatott elektróda a pipetta oldatába merül, lehetővé téve a tapaszmembránon belüli egyes ioncsatornák aktivitásának mérését.
